Ciencia COVID en hámster sirio

Hola shures según este estudio en preprint en el que se evalúan las variantes alfa y delta del covid.
Todavía no se comprende bien cómo la infección por SARS-CoV-2 influye en los factores fisiológicos del huésped importantes para la transmisión por aerosol. Evaluamos el patrón de respiración, las gotitas exhaladas y el virus infeccioso después de la infección con las variantes preocupantes (COV) alfa y delta en el hámster sirio. Ambos VOC mostraron una ventana confinada de virus aerotransportado detectable (24h - 48h), más corta que en comparación con los hisopos orofaríngeos. La pérdida de desprendimiento en el aire se relacionó con la constricción de las vías respiratorias, lo que resultó en una disminución de los aerosoles finos producidos. El sexo masculino se asoció con una mayor replicación viral y eliminación de virus en el aire, incluido un cambio del perfil de partículas independiente de COV hacia gotas más pequeñas. La eficiencia de transmisión varió entre los donantes, incluido un evento de superpropagación. La coinfección con COV solo ocurrió cuando ambos virus fueron eliminados por el mismo donante durante un período de tiempo de exposición mayor. Esto destaca que la evaluación de los factores del huésped y del virus que dan como resultado un perfil diferencial de partículas exhaladas es fundamental para comprender la transmisión por el aire.

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Este documento investiga los factores virales y del huésped que influyen en la transmisión de las variantes alfa y delta del SARS-CoV-2 en el modelo de hámster sirio y aumenta fundamentalmente el conocimiento sobre la transmisión del virus a través de la ruta del aerosol. La solidez de la evidencia es sólida y podría mejorarse con una presentación más clara de los datos.

La transmisión por partículas de virus en aerosol ha sido uno de los principales contribuyentes a la propagación del SARS-CoV-2 ( 1 2 ) [ ( 3 ) – ( 6 ) ]. Aunque son altamente eficientes en la prevención de enfermedades graves, las vacunas no reducen significativamente la transmisión de variantes preocupantes (COV) ( 7 ) . La transmisión ocurre cuando las personas liberan gotitas respiratorias que transportan el virus al (p. ej.) hablar, cantar, respirar, estornudar o toser. El tamaño de las gotas y la vida media en el aire no son uniformes ( 8 9 ) y dependen de los patrones de habla y respiración ( 10 ), gravedad de COVID-19 y parámetros fisiológicos como la edad ( 11 12 ) . Al igual que con la influenza ( 13 ) , el ARN del SARS-CoV-2 se detectó principalmente en aerosoles finos en humanos, a diferencia de los gruesos ( 11 ) . No está claro cómo el tamaño de las gotas exhaladas, los patrones de respiración e incluso la cantidad de virus infeccioso exhalado contribuyen fundamentalmente a la eficiencia de transmisión aérea in vivo.y cómo COVID-19 influye directamente en factores fisiológicos adicionales que pueden contribuir a la producción de aerosoles finos. Según se informa, existe una gran heterogeneidad en el potencial de transmisión de los individuos. Se han informado eventos de superpropagación en numerosas ocasiones a lo largo de la pandemia y se sugiere que son un factor importante ( 14, 15 ) . Se cree que surgen de una combinación de factores biológicos, sociales y aleatorios. Si bien la epidemiología humana y los estudios de modelado han resaltado varios factores que pueden contribuir a la heterogeneidad de la transmisión del SARS-CoV-2, incluida la carga viral ( 16 ), gran parte de la varianza observada sigue sin comprenderse bien. Actualmente, estos factores se estudian mejor en modelos de animales pequeños como el hámster sirio, que permiten comparaciones experimentales estrictas y controladas. El modelo de hámster sirio se ha utilizado ampliamente para estudiar la transmisión del SARS-CoV-2 ( 17 ) ; recapitula el contacto humano, los fómites y, lo que es más importante, la transmisión aérea de corta distancia y de aerosoles finos [ ( 18 ) – ( 21 ) ]. En este modelo, se observó la mayor eficiencia de transmisión aérea a corta distancia antes del inicio de la pérdida de peso y la patología pulmonar aguda, alcanzando su punto máximo un día después de la inoculación y correlacionando con las cargas de virus más altas en el tracto respiratorio superior de los animales donantes.( 22 ) . Hay datos disponibles sobre la pérdida de la función pulmonar en el modelo de hámster sirio después de la infección por SARS-CoV-2 ( 23, 24 ) , y se ha demostrado el virus en gotitas exhaladas ( 25 ) . Sin embargo, no se ha realizado un estudio sistemático que aborde cómo el potencial de transmisión aérea depende de estas características, junto con las influencias reconocidas del sexo y los VOC. El estudio de estos factores contribuyentes nos permitiría abordar cómo se unen para dar forma a los resultados de transmisión.

Aquí, presentamos un modelo matemático que delinea para los VOC alfa y delta la relación entre el virus infeccioso exhalado y el virus detectado en el tracto respiratorio superior durante la infección y detallamos longitudinalmente los cambios en la función pulmonar, la capacidad respiratoria y los perfiles de partículas exhaladas. Finalmente, evaluamos la competitividad y heterogeneidad de transmisión aérea in vivo de Alpha y Delta.

Resultados
El SARS-CoV-2 infeccioso máximo en muestras de aire se detecta entre 24 h y 48 h después de la infección
El modelado estructural y la comparación de entrada de pseudotipo sugirieron que el modelo de hámster sirio debería recapitular la ventaja competitiva específica de entrada de Delta sobre Alpha observada en humanos ( Figura S 1A-D) . Se inoculó a hámsters sirios con una dosis baja (10 3 TCID 50 , intranasal (IN), N = 10 por grupo) de SARS-CoV-2 Delta o Alpha. Los animales fueron monitoreados durante 14 días después de la inoculación (DPI). No observamos diferencias significativas en la pérdida de peso o los títulos virales en los cornetes pulmonares o nasales entre las variantes ( Figura S 2A-C ). A los 14 DPI, los hámsteres (N = 5) montaron una respuesta robusta de anticuerpos IgG anti-spike, y el patrón de unión general fue similar entre Alpha y Delta ( Figura S 2D , E). En un ensayo de neutralización de virus vivo, el virus homólogo se neutralizó significativamente mejor en comparación con la variante heteróloga ( Figura S 2F , G ), pero no se determinó una diferencia significativa entre la capacidad de neutralización frente a la respectiva variante homóloga (título de neutralización de virus recíproco medio = 320 (Alfa anti-Alfa)/ 320 (Delta anti-Delta), p = 0,9568, N = 5, ANOVA ordinario de dos vías, seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey).

Determinamos la ventana de eliminación de SARS-CoV-2 para Alpha y Delta usando hisopos del tracto respiratorio superior y muestras de aire de las jaulas, cuantificando el virus usando gRNA, sgRNA y títulos de virus infecciosos. Los hisopos orales se mantuvieron positivos para gRNA y sgRNA hasta 7 DPI, pero el virus infeccioso se redujo a niveles indetectables después de 4 DPI en la mayoría de las personas ( Figura S 3A) . Se tomaron muestras del aire de la jaula durante los primeros 5 días de infección en ventanas de tiempo de 24 h de jaulas que contenían 2 o 3 animales, agrupados por sexo. El gRNA y el sgRNA fueron detectables tan pronto como 1 DPI en el 50 % de las muestras de aire y se mantuvieron altos hasta los 5 DPI, mientras que el virus infeccioso alcanzó su punto máximo a los 2 DPI y fue detectable en un período más corto, de 1 a 4 DPI (Figura S 3B ) .

El modelo matemático demuestra que la diseminación en el aire alcanza su punto máximo más tarde y disminuye más rápido que la carga viral con hisopo oral
Cuantificamos la heterogeneidad en la excreción por variante, sexo y método de muestreo ajustando un modelo matemático de la cinética del virus dentro del hámster (ver Modelo matemático SI ) a los datos. El virus fue detectable y alcanzó su punto máximo antes en los hisopos orales (aproximadamente 24 h después de la inoculación) que el virus muestreado del aire (aproximadamente 48 h después de la inoculación), y la cantidad de virus detectado disminuyó más lentamente en los hisopos (Figura 1A, B). El gRNA y el sgRNA disminuyeron más lentamente que el virus infeccioso tanto en el aire como en los hisopos. Los datos de hisopos orales fueron un mal indicador de la diseminación en el aire, incluso cuando cuantificamos directamente los títulos de virus infecciosos. Esto se debió a un desfase entre el pico de excreción por hisopo y el pico de excreción en el aire. Las tasas de crecimiento y decaimiento exponencial dentro del huésped deducidas fueron similares para las dos variantes. Para ambas variantes, los machos arrojan más virus que las hembras, incluso después de tener en cuenta las tasas de respiración más altas de los machos en las mediciones de liberación en el aire. Encontramos una proporción ligeramente mayor de virus infecciosos a sgRNA en muestras de aire para Delta que para Alpha ( Figura 1B , Figura S 3C,D) . También encontramos una heterogeneidad sustancial a nivel individual en el desprendimiento aéreo, incluso después de tener en cuenta el sexo y la variante ( Figura 1B). Por ejemplo, las muestras de aire de la jaula 5 tenían más del doble de placas máximas per cápita que la jaula 6, aunque ambas jaulas contenían hámsteres del mismo sexo, inoculados con la misma dosis, vía y variante. Nuestro modelo captura esto, con una heterogeneidad inferida sustancial en el desprendimiento aéreo individual en UFP por hora, tanto en el tiempo como en la altura del pico ( Figura 1B )

Figura 1.

Perfiles de excreción de variantes alfa y delta en hisopos orales y muestras de aire.
Se inocularon hámsters sirios con 103 TCID 50 por vía intranasal con Alpha o Delta. un _ Comparación de la carga viral del hisopo y la diseminación del virus en el aire. Perfil inferido de desprendimiento de aire en UFP/h en comparación con los niveles de sgRNA y los títulos de virus infecciosos (TCID 50/mL) en hisopos orofaríngeos recolectados 1, 2, 3, 4, 5 y 7 DPI. Las líneas semitransparentes son 100 extracciones aleatorias de la distribución posterior inferida de la cinética dentro del huésped del hámster para cada una de las métricas. Los puntos unidos son series temporales medidas individuales para hámsters infectados experimentalmente; cada conjunto de puntos unidos es un individuo. Medidas e inferencias mostradas agrupadas por variante y sexo del animal. Los puntos de medición se alteran levemente al azar a lo largo del eje x (tiempo) para evitar la sobregraficación. B. El sgRNA viral y el virus infeccioso (PFU) se recuperaron de los filtros de muestra de aire de la jaula durante un período de 24 h a partir de 0, 1, 2, 3, 4 y 5 DPI. Los puntos son valores medidos, normalizados por el número de hámsters en la jaula (2 o 3) para dar valores per cápita. Las flechas que apuntan hacia abajo representan virus por debajo del límite de detección (0 placas observadas o número de copias estimado correspondiente a Ct ≥ 40). Las líneas semitransparentes son predicciones posteriores para la muestra que se habría recolectado si el muestreo comenzara en ese punto de tiempo; estos reflejan las concentraciones subyacentes inferidas de sgRNA y virus infeccioso en el aire de la jaula en cada momento y se calculan a partir de la cinética de infección inferida para cada uno de los hámsteres alojados dentro de la jaula. Se muestran 100 sorteos posteriores aleatorios para cada jaula. Jaulas alojadas 2 o 3 hamsters; todos los hámsteres dentro de una jaula eran del mismo sexo y estaban infectados con la misma variante. Los títulos de las columnas muestran el número de jaula y la variante, con el número y el sexo de los individuos entre paréntesis. Líneas punteadas límite de detección. Gris = alfa, verde azulado = delta, los valores p se indican cuando son significativos. Abreviaturas: sg, subgenómico; TCID, Dosis Infecciosa en Cultivo de Tejidos; PFU, unidad formadora de placa; F, hembra; M, macho; DPI, días post inoculación.

Los cambios en el perfil respiratorio después de la infección por SARS-CoV-2 preceden al inicio de la pérdida de peso y son variantes y dependen del sexo
La patología en los cornetes nasales y los pulmones no difirió significativamente entre los animales ( Figura S4 ). Los cambios patológicos fueron consistentes con los descritos anteriormente para COVID-19 en hámsters sirios después de la inoculación intranasal con otras cepas de SARS-CoV-2 ( 19 ) . Se realizó pletismografía de cuerpo entero (WBP). Enfocamos el análisis en los primeros 5 días después de la inoculación, en los cuales se observaron cambios en la eliminación y liberación del virus al aire ( Figura S 2A). Tiempo espiratorio (Te), tiempo inspiratorio (Ti), porcentaje de respiración ocupado por la transición de inspiración a espiración (TB), pausa espiratoria final (EEP), frecuencia respiratoria (f), flujo inspiratorio máximo (PIFb), flujo espiratorio máximo (PEFb), el volumen corriente (TVb), el volumen minuto (MVb) y la pausa intensificada (Penh) se utilizaron para evaluar los cambios en la función pulmonar durante la infección. Se utilizó el análisis de componentes principales para determinar las tendencias en los cambios de la función pulmonar en todos los grupos ( Figura 2A). Esto reveló un alto grado de variación inherente en las medidas individuales de pletismografía de hámster. Antes de la inoculación no había un patrón perceptible en el agrupamiento observado además de una ligera separación por sexo. A partir de 2 DPI, observamos una separación de animales infectados y de control. Esto coincidió con la observación de que todos los animales con SARS-CoV-2 disminuyeron visiblemente los niveles de actividad después de 2 DPI, reduciendo la actividad exploratoria y acicalándose con convulsiones cortas esporádicas que pueden representar tos. Ningún parámetro único tuvo una influencia abrumadora en el agrupamiento, aunque varios parámetros contribuyeron fuertemente durante todos los días: Te, Ti, TB, EEP, f, PIFb, PEFb, TVb y MVb (Figura 2B,C ) .

Figura 2.

Cambios en la función pulmonar y la respiración después de la infección por SARS-CoV-2 con Alpha y Delta.
Se inocularon hámsters sirios con 103 TCID 50 por vía intranasal con Alpha o Delta. un _ La función pulmonar se evaluó los días -1, 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mediante pletismografía de cuerpo entero. Se utilizó el análisis de componentes principales para investigar la varianza individual. Se representan los componentes principales (PC) 1 y 2 para cada día, mostrando animales individuales (los colores se refieren a la leyenda a la derecha, separados por sexo) y grupos (elipses negras). B. _ Gráficos de carga individuales para las contribuciones de las 6 variables principales a PC1 y 2 en cada día. C. Subconjunto relevante de parámetros de función pulmonar. Gráficos de líneas que representan la mediana y los valores de cambio de pliegue del IC del 95 % (izquierda) y el área bajo la curva (AUC, derecha), prueba de Kruskal-Wallis, valores de p indicados donde son significativos. Gris = alfa, verde azulado = delta, beige = control de anestesia, claro = masculino, oscuro = femenino. Abreviaturas: tiempo espiratorio (Te), tiempo inspiratorio (Ti), porcentaje de respiración ocupado por la transición de inspiración a espiración (TB), pausa espiratoria final (EEP), frecuencia respiratoria (f), flujo inspiratorio máximo (PIFb), pico flujo espiratorio (PEFb), volumen tidal (TVb), volumen minuto (MVb), pausa intensificada (Penh), hombre (M), mujer (F).

Surgieron patrones amplios por variante y por sexo. Los valores acumulados del AUC de Penh para todos los grupos infectados aumentaron en comparación con los hámsteres de control emparejados por sexo (p = 0,022, prueba de Kruskal-Wallis, N = 5). Los valores medianos del AUC de Penh para machos alfa, delta y de control fueron 0,741, 2,666 y 0,163, respectivamente (p = 0,062). Los valores medianos de AUC de Penh para las hembras alfa, las hembras delta y las hembras de control fueron 1,783, 2,255 y 0,159, respectivamente (p = 0,019). A los 4 DPI, la mediana de los valores de Penh de cambio de veces para los machos alfa y los machos delta fueron 0,793 y 1,929, respectivamente, en comparación con 0,857 para los machos de control. Los valores de Penh correspondientes para las hembras Alfa, Delta y de control fueron 1,736, 1,410 y 1,008, respectivamente. La separación en 4 DPI no se tradujo en cambios significativos en las medidas más tradicionales de la función respiratoria, incluidas f, TVb,

Los cambios en el perfil aerodinámico del aerosol exhalado después de la infección por SARS-CoV-2 preceden a la enfermedad aguda, son variantes y dependen del sexo
Los grupos inoculados con alfa y delta (N = 10 cada uno) y un grupo de control (N = 10) se evaluaron individualmente en 0, 1, 3 y 5 DPI. En cada grupo de variantes, el tamaño de diámetro de partícula <0,53 µm fue el más abundante ( Figura 3A ). No se observó ningún cambio global significativo y coherente en el número de partículas globales en todos los tamaños entre los grupos ( Figura S5C ). Se examinaron partículas de entre 1 y 10 µm de diámetro, las más relevantes para la transmisión de aerosoles finos ( 26 ) . Al inicio del estudio (0 DPI), las hembras de todos los grupos produjeron una mayor proporción de gotas en el rango de 1 a 10 µm de diámetro en comparación con los machos ( Figura 3A,B). A 3 DPI, los perfiles de partículas cambiaron hacia diámetros aerodinámicos más pequeños en los grupos infectados. A 5 DPI, incluso los animales de control demostraron un comportamiento exploratorio reducido, lo que resultó en una reducción de partículas en el rango de 1-10 µm, lo que podría deberse a la aclimatación a la cámara. Esto resultó en un cambio general en el tamaño de partícula del rango de 1-10 µm al rango de <0,53 µm. Para analizar estos datos, se calcularon las pendientes individuales para cada animal usando una regresión lineal simple en los cuatro puntos de tiempo (Porcentaje ∼ Intersección + Pendiente * Día) para el porcentaje de partículas en el rango de <0,53 µm y el porcentaje de partículas en el rango de 1-10 µm ( Figura 3C,D), y se realizó una regresión lineal múltiple. Manteniendo constante el grupo de variantes, la pendiente del porcentaje de partículas en el rango de 1-10 µm fue, en promedio, 2,2 veces mayor para los hombres en comparación con las mujeres, mientras que la estimación del modelo <0,53 µm fue 1,7 veces menor. Comparando el grupo de variantes mientras mantenemos el sexo constante, encontramos que el grupo Delta tuvo una disminución más pronunciada para el porcentaje de partículas en el rango de 1-10 µm (y una inclinación más pronunciada para <0,53 µm); Se observó una tendencia similar, pero no tan pronunciada, para Alpha. Después de ajustar las comparaciones múltiples con Tukey, se observaron diferencias en las pendientes de <0,53 µm para Delta frente a Control (5,4 veces más alto, dos lados p = 0,0001) y Delta frente a Alfa (3 veces más alto, dos lados p = 0,0280) , y para Alpha vs. Control, 2,4 veces mayor (bilateral p = 0,0874); para el modelo de 1-10 µm,

Figura 3:

Análisis de partículas aerodinámicas de hámsters infectados con SARS-CoV-2.
un _ Se inocularon hámsters sirios con 103 TCID 50 por vía intranasal con Alpha o Delta. El perfil del diámetro aerodinámico de las partículas exhaladas se analizó los días 0, 1, 3 y 5. El mapa de calor muestra el porcentaje medio redondeado de partículas totales en todos los grupos, incluido el grupo de control de anestesia (N = 10, compuesto por 5 hombres y 5 mujeres). Los colores se refieren a la escala a continuación. B. _ Para cada animal, gráfico de líneas del porcentaje de partículas en el rango de diámetro de 1-10 µm por grupo variante y sexo indicado por color. C / D. Las pendientes individuales para el porcentaje de partículas en el rango <0,53 µm (arriba) y 1-10 µm (abajo) se presentan por sexo y grupo de variantes. Los diagramas de caja representan la mediana, el rango intercuartílico y el rango. Regresión lineal múltiple realizada para cada rango de diámetro con grupo y sexo como predictores, estadístico F (3,26) = 9,47 para modelo <0,53 µm y estadístico F (3,26) = 2,62 para modelo 1-10 µm, con Tukey ajuste de comparación múltiple para las tres comparaciones de grupos de variantes (nivel de confianza familiar del 95 %). Para un rango de <0,53, hombre-mujer (estimación = −1,7, error estándar = 0,888, p bilateral = 0,0659); Alpha-Control (estimación = 2,41, error estándar = 1,09, dos caras p = 0,0874), Delta-Control (estimación = 5,40, error estándar = 1,09, dos caras p = 0,0001), Delta-Alpha (estimación = 2,99, error estándar = 1,09, p bilateral = 0,0280). Para el rango 1-10, Hombre-Mujer (estimación = 2,19, error estándar = 1,23, p bilateral = 0,0875); Alpha-Control (estimación = −0,633, error estándar = 1,51, dos caras p = 0,9079), Delta-Control (estimación = −3,098, error estándar = 1,51, dos caras p = 0,1197), Delta-Alpha (estimación = −2,465, error estándar = 1,51, p bilateral = 0,2498). Gris = Alfa, verde azulado = Delta, beige = control de anestesia, rojo = femenino, azul = masculino.

Las tasas de ataque de COV alfa y delta revelan un riesgo individual mínimo de infección dual in vivo
Luego comparamos las tasas de ataque entre Alpha y Delta durante una ventana de exposición de 4 h a una distancia de 200 cm. Se expusieron grupos de centinelas (N = 4 o 5) a dos animales donantes, uno inoculado con Alpha y otro inoculado con Delta ( Figura 4A ).

Figura 4.

Tasa de ataque aerotransportado de las variantes Alpha y Delta SARS-CoV-2.
Los animales donantes (N = 7) se inocularon con la variante Alfa o Delta con 10 3 TCID 50 por vía intranasal y se emparejaron al azar (proporción 1:1) en 7 escenarios de tasa de ataque (AG). Para cada par de donantes, un día después de la inoculación, se expusieron 4-5 centinelas durante 4 horas (es decir, horas 24-28 después de la inoculación) en una instalación de transmisión de aerosol a una distancia de 200 cm. un _ Figura esquemática del montaje de la transmisión. B. _ sgRNA del día 1 detectado en hisopos orales tomados de cada donante después de que finalizó la exposición. Se representan individuos. Prueba de Wilcoxon, N = 7. Gris = Alfa, verde azulado = Donantes inoculados con Delta. C. Desprendimiento respiratorio medido por carga viral en hisopos orofaríngeos; medido por sgRNA en los días 2, 3 y 5 para cada centinela. Los animales se agrupan por escenario. Los colores se refieren a la leyenda de la derecha. 3.3 = límite de calidad. D/E . Porcentaje de alfa y delta detectado en hisopos orofaríngeos tomados el día 2 y el día 5 después de la exposición para cada individuo determinado por secuenciación profunda. Los gráficos circulares representan animales individuales. Gris = Alfa, verde azulado = Delta.

sgRNA en hisopos orales tomados en 1 DPI varió entre animales ( Figura 4B ). Los centinelas se expusieron primero durante 2 h a una variante y luego durante 2 h a la segunda ( Figura 4C , primeras 4 iteraciones), o a ambas variantes al mismo tiempo durante 4 h (últimas tres iteraciones). La transmisión fue confirmada por sgRNA en hisopos orales recolectados de todos los centinelas en 2, 3 y 5 DPE. En 2 DPE, N = 13/34 centinelas dieron positivo para sgRNA en hisopos orales, N = 19/34 en 3 DPE y N = 27/34 en 5 DPE. Se secuenciaron hisopos de 3 DPE y 5 DPE, y se comparó el porcentaje de lecturas asignadas a Alfa y Delta ( Figura 4D,E ).

Todos los animales tenían solo una variante detectable el día 3. En total, 12 centinelas fueron infectados con Alpha y 7 con Delta por 3 DPE. En 5 DPE, un poco más de centinelas arrojaron Alpha (N = 15 frente a N = 12). Curiosamente, observamos un evento de superpropagación en la iteración A, en el que un animal donante transmitió Alpha a todos los centinelas. Para todas las demás iteraciones, ambos donantes lograron transmitir al menos a un centinela o no todos los centinelas estaban infectados. Para las iteraciones con exposición simultánea, las tasas de ataque fueron similares y estadísticamente indistinguibles: Alfa = 50 %, Delta = 42,8 %. En una exposición simultánea (iteración F), tres centinelas tenían Delta y Alfa detectables en 5 DPE. En dos Delta era dominante, y en uno Alfa, siempre con la otra variante en clara minoría (<15%). No observamos ninguna otra coinfección de este tipo (definida como un animal PCR positivo con Alpha y Delta con una frecuencia del 5 % o superior mediante NGS). Esto nos llevó a preguntarnos si había interferencia del virus en exposiciones secuenciales, es decir, si la infección establecida con una variante podría reducir la probabilidad de infección exitosa dada una exposición posterior.

Para evaluar esto, usamos nuestro modelo de dinámica dentro del huésped para calcular las probabilidades de infección estimadas para Alfa y Delta para cada centinela en cada iteración, asumiendo que cada centinela está expuesto de forma independiente, pero teniendo en cuenta las diferentes duraciones de exposición, sexos de donantes y virales de donantes. carga (medida con hisopos orales). A partir de esas probabilidades, luego calculamos las distribuciones de probabilidad posteriores para la cantidad de coinfecciones que se predijo que ocurrirían en cada iteración si las infecciones alfa y delta ocurrieran de forma independiente y no interfirieran entre sí ( Figuras del modelo matemático SI SI1-3). Encontramos que nuestras coinfecciones observadas eran consistentes con este modelo nulo; nuestros datos no proporcionan una evidencia clara de la interferencia del virus durante la exposición secuencial, aunque tampoco descartan dicho efecto. No se observaron diferencias en la replicación del virus o la gravedad de la enfermedad entre los centinelas infectados con Alpha o Delta ( Figura S 6 )

Sostenibilidad limitada de poblaciones heterólogas de COV a través de múltiples rondas de transmisión aérea
Para evaluar la eficiencia de transmisión en competencia directa entre los COV alfa y delta, llevamos a cabo un experimento de transmisión aérea durante tres rondas de exposición posteriores ( 21 ) . Los animales donantes (N = 8) se inocularon IN con 5 × 10 2 TCID 50 de Alpha y 5 × 10 2 TCID 50 Delta (mezcla 1:1) y se expusieron ocho centinelas (Centinelas 1, relación 1:1) en 1 DPI durante 24 h (primer eslabón de la cadena, ventana de exposición: 24-48 h post inoculación de los donantes) ( Figura 5). Dos días después del comienzo de esta exposición, los ocho centinelas se colocaron en el lado del donante de una nueva jaula y ocho centinelas nuevos (Centinelas 2) se expusieron durante 24 horas (segundo eslabón de la cadena, ventana de exposición 48-72 h después del inicio de la exposición). los centinelas 1). Nuevamente, 2 días después del inicio de la exposición, esta secuencia se repitió para Sentinels 3 (tercer eslabón de la cadena, ventana de exposición 48-72 h después del inicio de la exposición de Sentinels 2). Todos los animales se alojaron individualmente entre exposiciones y después de la exposición también para los centinelas. Evaluamos la presencia viral en hisopos orofaríngeos tomados de todos los animales a 2 y 5 DPI/DPE. Mientras que todos los Sentinels 1 demostraron excreción activa a los 2 y 5 DPE, en el grupo de Sentinels 2 no se detectó ARN viral en 2/8 animales y ningún virus infeccioso en 4/8 a los 5 DPE. En el grupo Sentinels 3, El sgRNA y el virus infeccioso solo se detectaron de manera sólida en un animal en 5 DPE. En contraste con los animales donantes, todos los centinelas infectados exhibieron una mayor excreción en el día 5 en comparación con el día 2 (2 DPI / 5 DPI Donantes: mediana de ARNg = 7,8 / 6,9 copias/mL (Log10 ), sgRNA mediana = 7,2/6,4 copias/mL (Log 10 )), título de virus infeccioso mediano = 2,3/0,5 TCID 50 /mL (Log 10 ); Sentinels 1 (mediana de ARNg = 7,2/7,4 copias/mL (Log 10 ), mediana de sgRNA = 6,4/6,9 copias/mL (Log 10 ), mediana de títulos de virus infecciosos = 2,9/2,6 TCID 50 /mL (Log 10 ); Centinelas 2 = mediana de ARNg = 3,7 / 5,4 copias/mL (Log 10 ), mediana de sgRNA = 1,8 / 3,0 copias/mL (Log 10 ), mediana de títulos de virus infecciosos = 0,5 / 1,6 TCID 50 /mL (Log 10 )) ( Figura 5A). En conjunto, esta evidencia sugiere que el perfil de diseminación infecciosa cambia más tarde y disminuye en magnitud con las sucesivas generaciones de transmisión. Esto podría explicarse por dosis de exposición más bajas que causan infecciones más bajas y más lentas en los receptores.

Figura 5.

Competitividad aerotransportada de las variantes Alpha y Delta SARS-CoV-2.
Los animales donantes (N = 8) fueron inoculados con la variante Alfa y Delta con 5 × 10 2 TCID 50 , respectivamente, por vía intranasal (proporción 1:1), y tres grupos de centinelas (Centinelas 1, 2 y 3) fueron expuesto posteriormente a una distancia de 16,5 cm. Los animales fueron expuestos en una proporción de 1:1; la exposición ocurrió el día 1 (Donantes ⟶ Centinelas 1) y el día 2 (Centinelas ⟶ Centinelas). un _ Desprendimiento respiratorio medido por carga viral en hisopos orofaríngeos; medido por gRNA, sgRNA y títulos infecciosos en los días 2 y 5 posteriores a la exposición. Gráfico de barras que representa la mediana, IC del 96 % e individuos, N = 8, ANOVA normal de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Šídák. B/C/D. ARNg, ARNsg y virus infecciosos correspondientes en pulmones y cornetes nasales muestreados cinco días después de la exposición. Gráfico de barras que representa la mediana, IC del 96 % e individuos, N = 8, ANOVA normal de dos vías, seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Šídák. Naranja oscuro = Donantes, naranja claro = Centinelas 1, gris = Centinelas 2, gris oscuro = Centinelas 3, los valores p se indican cuando son significativos. Línea punteada = límite de calidad. mi _ Porcentaje de alfa y delta detectado en hisopos orofaríngeos tomados en los días 2 y 5 después de la exposición para cada donante individual y centinela, determinado por secuenciación profunda. Los gráficos circulares representan animales individuales. Gris = Alfa, verde azulado = Delta. F. _ Muestras de cornetes pulmonares y nasales. Abreviaturas: TCID, Dosis infecciosa de cultivo tisular.

Luego se procedió a comparar las cargas virales en pulmones y cornetes nasales a los 5 DPE. Se detectó ARNg viral en los pulmones ( Figura 5B ) y cornetes nasales ( Figura 5C ) de todos los donantes (pulmones: ARNg mediana = 9,7 copias/gr de tejido (Log 10 ), cornetes nasales: ARNg mediana = 6,2 copias/gr de tejido (Log 10 )). Curiosamente, mientras que la cantidad de ARNg fue similar en los pulmones entre Donantes y Sentinels 1 (pulmones: ARNg mediana = 9,5 copias/gr de tejido (Log 10 )), aumentó en los cornetes nasales para el grupo Sentinel 1 (cornetes nasales: ARNg mediana = 8,6 copias/gr de tejido (Log 10)). De manera similar, el sgRNA aumentó en Sentinels 1 en comparación con los donantes en los cornetes nasales, pero no en los pulmones (Donantes = pulmones: mediana de sgRNA = 9,4 copias/gr de tejido (Log 10 ), cornetes nasales: mediana de sgRNA = 5,7 copias/gr de tejido ( Log10 ); Centinelas 1 = pulmones: mediana de sgRNA = 9,2 copias/gr de tejido (Log 10 ), cornetes nasales: mediana de sgRNA = 8,4 copias/gr de tejido (Log 10)). El gRNA viral por encima del nivel de cuantificación fue detectable en 6/8 Sentinels 2 tanto en pulmones como en cornetes nasales, sin embargo, el sgRNA solo se detectó en 4/8 Sentinels 2 en pulmones y 5/8 en cornetes nasales. Aunque se detectó gRNA en 3/8 Sentinels 3, ningún animal tenía sgRNA detectable ni en los pulmones ni en los cornetes nasales, lo que indica una falta de replicación activa del virus. Para confirmar esto, se analizó el virus infeccioso en ambos tejidos para los grupos de Donantes, Centinelas 1 y Centinelas 2 ( Figura 5D ). En ambos tejidos, los títulos fueron marginalmente más altos en Sentinels 1 (mediana de TCID 50 / gr de tejido (Log 10) Donantes: pulmones = 8,6, cornetes nasales = 8,0; Centinelas 1: pulmones = 8,9, cornetes nasales = 8,8). El virus infeccioso estuvo presente en 6/8 Sentinels 2 en pulmones y 5/8 en cornetes nasales. Por lo tanto, aunque el intervalo de exposición para el segundo y el tercer eslabón de la cadena se inició 48 horas después del inicio de su propia exposición, no todos los Sentinel 2 se infectaron y solo un animal de Sentinel 3 se infectó y mostró excreción. Realizamos un experimento separado para evaluar las cargas virales en el tracto respiratorio después de la transmisión aérea del SARS-CoV-2 a 2 DPI/DPE. Si bien el virus infeccioso estuvo presente en los hisopos orales de todos los centinelas, el virus en los pulmones y los cornetes nasales no estuvo presente en todos los animales ( Figura S 7 ).

Para determinar la competitividad de las variantes, analizamos la composición relativa de los dos virus utilizando la secuenciación de próxima generación ( Figura 5E, F). Ninguna variante superó significativamente a la otra. Primero comparamos el porcentaje de Delta en hisopos orales tomados en 2 DPI/DPE, el día de exposición del siguiente eslabón de la cadena. En los donantes, ninguna variante prevaleció más entre los animales ni superó claramente a la otra dentro de un huésped (mediana = 56,5 % delta, rango = 40,3-69 %). Después del primer evento de transmisión, Delta superó a Alpha en 2 DPE (mediana = 87,3 % Delta, rango = 19-92,7 %), mientras que después del segundo evento de transmisión, la mitad (N = 2/4) de los animales arrojaron > 80 % o alfa o delta. En particular, y en fuerte contraste con los experimentos de donantes duales descritos anteriormente, cada animal centinela exhibió una infección mixta en 2 DPE, a menudo con proporciones similares a las del donante.

A continuación, analizamos la presión selectiva dentro del huésped. A los 5 DPI/DPE, no se observó una diferencia clara en los donantes (mediana = 60 % Delta, rango = 34,3-67,7 %), pero en el grupo de Sentinels 1 Alpha superó a Delta en tres animales (mediana = 68,3 % Delta, rango = 17 -92,3%), mientras que nunca se vio lo contrario. En un animal, observamos una infección equilibrada establecida entre ambas variantes a los 5 DPE (Sentinel 1.8). En el grupo Sentinels 2, Alpha fue la variante dominante en N = 3/8 animales y Delta dominó en 3/8 (mediana = 55% Delta, rango = 17-92,7%). El único animal de Sentinel 3 para el que se produjo la transmisión se desprendió casi exclusivamente de Alfa. Esto sugiere que dentro de un huésped, Alpha tuvo un éxito marginalmente mayor al superar a Delta en la cavidad orofaríngea.

Luego evaluamos las secuencias de virus en los pulmones y los cornetes nasales para comprender si la dinámica espacial influye en la presión selectiva. En los pulmones de donantes, el porcentaje de Alfa fue marginalmente mayor en 5 DPI (mediana = 42,3% Delta, rango = 23,3-75,7%). En los grupos Sentinels, Alpha o Delta superaron a la otra variante dentro de cada animal, solo un animal (Sentinel 1.8) reveló ambas variantes > 15%. En N = 5/8 Sentinels 1, pero solo en N = 1/4 Sentinel 2 animales, Delta superó a Alpha. La secuenciación del virus aislado de los cornetes nasales reprodujo este patrón. En Donantes, ninguna de las variantes demostró una ventaja completa (mediana = 51,2% Delta, rango = 38,7-89,3%). En N = 5/8 Sentinels 1 y N = 3/8 Sentinels 2, Delta superó a Alpha.

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